Hướng dẫn lâm sàng

Trang chủ

Các phương pháp phân tích huyết sắc tố và xét nghiệm bệnh lý huyết sắc tố

Xuất bản:

Cập nhật:

MỤC LỤC

TÓM TẮT

Chuỗi globin

  • Hemoglobin người (Hb) là các protein cấu trúc bốn tiểu đơn vị (tetramer) gồm hai cặp chuỗi globin (hình 1); các chuỗi đặc hiệu này được điều hòa chặt chẽ trong quá trình phát triển (hình 2). Bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy) bao gồm một nhóm các rối loạn do đột biến di truyền ảnh hưởng đến một hoặc nhiều chuỗi globin dạng alpha (giống alpha), dạng beta (giống beta), hoặc sự kết hợp cả hai. Chúng được phân loại rộng rãi thành các biến thể huyết sắc tố cấu trúc và bệnh thalassemia. (Xem thêm mục ‘Sinh học hemoglobin’ phía trên).

Phương pháp xét nghiệm

  • Các phương pháp dựa trên protein vẫn là lựa chọn ưu tiên cho việc phân tích Hb ban đầu. Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản vùng (CZE), lấy điểm đẳng điện (IEF) và điện di trên gel. Các phương pháp dựa trên DNA thường không được sử dụng làm xét nghiệm đầu tay hoặc sàng lọc, mặc dù vai trò này đang dần phát triển. Bảng dưới đây liệt kê các ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp này (bảng 1). Một số xét nghiệm tại điểm chăm sóc (point-of-care) đổi mới đang trong quá trình phát triển, có thể sử dụng trực tiếp tại nơi và thời điểm đánh giá bệnh nhân, đặc biệt là ở những vùng có nguồn lực hạn chế (bảng 2). (Xem thêm mục ‘Các phương pháp xét nghiệm hiện có’ phía trên).

Bối cảnh chỉ định xét nghiệm phù hợp

Cách tiếp cận lựa chọn xét nghiệm

  • Các cách tiếp cận thông thường đối với việc sàng lọc sơ sinh và đánh giá cận lâm sàng các trường hợp nghi ngờ bệnh hồng cầu liềm (SCD), nghi ngờ thalassemia, và các biến thể hemoglobin chưa rõ nguyên nhân đã được mô tả ở trên. Bảng dưới đây tóm tắt các đặc điểm hình thái Hb thường gặp trong những tình trạng này (bảng 3). (Xem thêm mục ‘Các kịch bản lâm sàng thường gặp’ phía trên).

Xét nghiệm chuyên sâu

  • Phân tích tại phòng xét nghiệm tuyến tham chiếu thường được chỉ định nếu một bất thường không thể xác định rõ bằng các xét nghiệm thường quy (ví dụ: thiếu máu huyết tán thể Heinz, tăng hồng cầu không rõ nguyên nhân, tím môi/da không rõ nguyên nhân, hoặc thiếu máu không rõ nguyên nhân mà các xét nghiệm khác không cho kết quả chẩn đoán), hoặc khi kiểu hình bệnh khác biệt với kết quả xét nghiệm lâm sàng ban đầu. Thông tin liên hệ của các phòng xét nghiệm tham chiếu tại Hoa Kỳ được liệt kê ở trên. (Xem thêm mục ‘Chuyển gửi đến phòng xét nghiệm chuyên sâu’ phía trên).

Chẩn đoán các rối loạn hemoglobin cụ thể

GIỚI THIỆU

Hemoglobin (Hb) là loại protein dồi dào có chức năng vận chuyển oxy nằm bên trong hồng cầu, có cấu trúc dạng thể bốn (tetramer) gồm hai chuỗi globin giống alpha và hai chuỗi globin giống beta, mỗi chuỗi globin liên kết với một nhóm heme. Các bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathies) là một nhóm rối loạn máu di truyền phức tạp, trong đó có một hoặc nhiều bất thường di truyền dẫn đến sự thay đổi về số lượng, cấu trúc hoặc chức năng của một hay nhiều chuỗi globin. Ngược lại, các bất thường trong quá trình tổng hợp heme sẽ dẫn đến thiếu máu nguyên hồng cầu sắt (sideroblastic anemias) và bệnhporphyria.

Các bệnh lý huyết sắc tố phổ biến nhất bao gồm bệnh thalassemia (alphal và beta) và bệnh hồng cầu hình liềm (SCD); ngoài ra còn có hàng trăm biến thể khác đã được mô tả.

Việc chẩn đoán bệnh huyết sắc tố đòi hỏi sự am hiểu về di truyền học và cấu trúc của các chuỗi globin cũng như Hb. Chẩn đoán chính xác và kịp thời có vai trò quan trọng nhằm định hướng phác rối điều trị tối ưu, đồng thời cung cấp tư vấn di truyền và các lựa chọn sinh sản cho người mang gen bệnh.

Chủ đề này tổng quan các phương pháp xét nghiệm bệnh lý huyết sắc tố. Các thông tin bổ sung về chẩn đoán từng rối loạn cụ thể và tổng quan về xét nghiệm sàng lọc trước sinh bệnh huyết sắc tố được trình bày ở các mục riêng biệt:

SINH HỌC HEMOGLOBIN

Hemoglobin bình thường

Hemoglobin (Hb) ở người là các protein cấu trúc tetramer (bốn tiểu đơn vị), bao gồm hai cặp chuỗi globin, mỗi chuỗi gồm một chuỗi giống alpha (chuỗi $\alpha$-like) và một chuỗi giống beta (chuỗi $\beta$-like). Mỗi chuỗi globin liên kết với một nhóm heme chứa sắt (hình 1).

Trong suốt vòng đời, quá trình tổng hợp các chuỗi giống alpha và giống beta (còn gọi là chuỗi không phải alpha – non-alpha-like) luôn được điều hòa cân bằng để tỷ lệ giữa chúng đạt mức cân bằng chặt chẽ (1:1), sao cho không có loại chuỗi nào bị dư thừa 1. (Xem “Cấu trúc và chức năng của các hemoglobin bình thường”, mục ‘Hemoglobin phôi’).

Các chuỗi giống alpha và giống beta cụ thể được tích hợp vào phân tử Hb chịu sự kiểm soát chặt chẽ trong suốt quá trình phát triển phôi thai và trưởng thành (hình 2):

  • Hemoglobin phôi (Embryonic Hbs): Được tổng hợp từ rất sớm, khoảng tuần thứ 4 đến tuần thứ 6 của thời kỳ phôi thai và biến mất vào khoảng tuần thứ 8 của thai kỳ khi được thay thế bởi hemoglobin bào thai 2,3. Các hemoglobin phôi bao gồm:

    • Hb Gower-1: gồm hai chuỗi globin $\zeta$ (zeta) và hai chuỗi globin $\epsilon$ (epsilon) ($\zeta_{2}\epsilon_{2}$).
    • Hb Gower-2: gồm hai chuỗi alpha globin và hai chuỗi epsilon globin ($\alpha_{2}\epsilon_{2}$).
    • Hb Portland: gồm hai chuỗi zeta globin và hai chuỗi gamma globin ($\zeta_{2}\gamma_{2}$).

  • Hemoglobin bào thai (Hb F): Được sản xuất từ khoảng tuần thứ 8 của thai kỳ cho đến khi sinh và chiếm khoảng 80% tổng lượng Hb ở trẻ sơ sinh đủ tháng. Tỷ lệ này giảm dần trong những tháng đầu đời và ở trạng thái bình thường, Hb F chiếm dưới 1% tổng lượng Hb từ thời thơ ấu. Hb F được cấu tạo từ hai chuỗi alpha globin và hai chuỗi gamma globin ($\alpha_{2}\gamma_{2}$).

  • Hemoglobin người trưởng thành (Hb A): Là loại Hb chiếm ưu thế ở trẻ em từ 6 tháng tuổi trở đi; chiếm từ 96 đến 97% tổng lượng Hb ở những người không mắc bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy). Hb A gồm hai chuỗi alpha globin và hai chuỗi beta globin ($\alpha_{2}\beta_{2}$).

  • Hb A2: Là một loại Hb trưởng thành chiếm tỷ lệ nhỏ, ở trạng thái bình thường chiếm khoảng 2,5 đến 3,5% tổng lượng Hb từ 6 tháng tuổi trở đi. Hb A2 gồm hai chuỗi alpha globin và hai chuỗi delta globin ($\alpha_{2}\delta_{2}$).

Sự điều hòa các gene globin và quá trình chuyển đổi phát triển từ dạng Hb này sang dạng Hb khác được thảo luận chi tiết ở phần riêng. (Xem “Cấu trúc và chức năng của các hemoglobin bình thường”, mục ‘Hemoglobin phôi’).

Các dạng bất thường

Bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy) có thể được phân loại rộng rãi thành các biến thể cấu trúc huyết sắc tố (Hb), trong đó biến thể di truyền gây ra sự thay đổi về cấu trúc và thường cả chức năng của Hb; và bệnh thalassemia (tan máu bẩm sinh), trong đó biến thể di truyền gây ra sự thay đổi về số lượng chuỗi globin được sản xuất (hình 3).

Cơ chế bệnh sinh và biểu hiện lâm sàng của các bệnh lý huyết sắc tố cũng rất đa dạng. Nhìn chung, hầu hết các biến thể cấu trúc Hb có ý nghĩa lâm sàng đều gây ra tình trạng tan máu trong máu ngoại vi. Ngược lại, beta thalassemia chủ yếu đặc trưng bởi tình trạng tạo hồng cầu không hiệu quả và sự phá hủy các tiền thân hồng cầu trong tủy xương.

Một số tình trạng, chẳng hạn như bệnh Hb H (một dạng alpha thalassemia), gây ra cả hiện tượng tan máu và tạo hồng cầu không hiệu quả.

Thiếu máu có thể diễn tiến nặng, ví dụ như ở bệnh nhân alpha hoặc beta thalassemia phụ thuộc truyền máu (TDT). Bệnh hồng cầu hình liềm (SCD) cũng gây ra các hiện tượng tắc mạch.

Ngoài ra, cách tiếp cận xét nghiệm chẩn đoán đối với các trường hợp nghi ngờ mắc bệnh lý huyết sắc tố cũng có sự khác biệt, như được thảo luận dưới đây. (Xem ‘Các phương pháp xét nghiệm hiện có’ dưới đây và ‘Đánh giá ban đầu’ dưới đây).

Biến thể huyết sắc tố (Hb variants)

  • Các biến thể cấu trúc Hb là rối loạn định tính làm thay đổi cấu trúc (bậc một, bậc hai, bậc ba và/hoặc bậc bốn) của phân tử Hb. Phần lớn các biến thể Hb không gây bệnh và thường được phát hiện một cách tình cờ hoặc thông qua sàng lọc sơ sinh. Một tập hợp nhỏ các biến thể Hb có thể gây bệnh lý nặng khi được di truyền ở trạng thái đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép kết hợp với một biến thể cấu trúc khác hoặc một đột biến thalassemia. Hiếm khi các biến thể dị hợp tử có thể biểu hiện kiểu hình (di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường). Các ví dụ phổ biến về biến thể liên quan đến tan máu bao gồm Hb S (huyết sắc tố liềm) và Hb C. Các biến thể Hb thường có thể được phát hiện bằng các phương pháp xét nghiệm dựa trên protein; tuy nhiên, các phương pháp dựa trên DNA có thể cần thiết đối với các biến thể có kết quả xét nghiệm protein không rõ ràng hoặc bất thường. (Xem ‘Phương pháp hóa học protein’ dưới đây và ‘Phương pháp di truyền phân tử (dựa trên DNA)’ dưới đây).

Hậu quả chức năng chính của các biến thể cấu trúc Hb có thể được phân loại như sau:

Thay đổi tính chất vật lý (độ hòa tan)

Giảm độ ổn định của protein (tính bất ổn định)

Thay đổi ái lực với oxy

  • Các biến thể Hb có ái lực với oxy cao hoặc thấp có xu hướng chuyển sang trạng thái giãn (R, gắn oxy) hoặc trạng thái căng (T, mất oxy) nhiều hơn so với bình thường. Các biến thể có ái lực oxy cao (trạng thái R) có thể gây tăng hồng cầu tương đối (ví dụ: Hb Chesapeake, Hb Montefiore). Một số biến thể có ái lực oxy thấp có thể gây thiếu máu (mặc dù khả năng cung cấp oxy cho mô là bình thường) thậm chí gây chứng xanh tím do giảm bão hòa oxy. Các ví dụ bao gồm Hb Kansas và Hb Beth Israel. (Xem “Các biến thể huyết sắc tố làm thay đổi ái lực của huyết sắc tố với oxy”).

Oxy hóa sắt nhân heme

  • Các đột biến ở vị trí gắn heme, đặc biệt là các đột biến ảnh hưởng đến các gốc histidine gần hoặc xa được bảo tồn, có thể tạo ra M-hemoglobin, trong đó nguyên tử sắt trong nhân heme bị oxy hóa từ trạng thái sắt hóa trị hai ($\text{Fe}^{2+}$) sang trạng thái sắt hóa trị ba ($\text{Fe}^{3+}$), dẫn đến hậu quả là bệnh methemoglobin huyết.

Thalassemia (Tan máu bẩm sinh)

  • Thalassemia là các rối loạn định lượng làm giảm mức độ của một loại chuỗi globin, tạo ra sự mất cân bằng về tỷ lệ giữa chuỗi alpha và chuỗi giống beta. Tỷ lệ này thường được điều hòa chặt chẽ để ngăn chặn tình trạng tích tụ dư thừa một loại chuỗi globin. Các chuỗi không thể kết hợp vào Hb sẽ tạo thành các tập hợp không có chức năng, bị kết tủa bên trong hồng cầu, gây phá hủy hồng cầu sớm trong tủy xương (đặc biệt trong beta thalassemia) và/hoặc máu ngoại vi (đặc biệt trong alpha thalassemia). (Xem “Di truyền học phân tử của các hội chứng thalassemia” và “Sinh lý bệnh của thalassemia”).

Beta thalassemia

  • Beta thalassemia có mức độ giảm (thiếu hụt tương đối) các chuỗi beta globin. Beta thalassemia thường do các đột biến điểm làm gián đoạn các yếu tố điều hòa biểu hiện gen beta globin. Các đột biến beta thalassemia được phân loại là alen beta$^+$ ($\text{b}^+$) nếu vẫn có một lượng nhỏ beta globin được sản xuất, hoặc beta$^0$ ($\text{b}^0$) nếu hoàn toàn không có sự sản xuất beta globin từ gen đó. (Xem “Chẩn đoán thalassemia (người lớn và trẻ em)”).

Alpha thalassemia

  • Alpha thalassemia có mức độ giảm (thiếu hụt tương đối) các chuỗi alpha globin. Phần lớn các trường hợp alpha thalassemia là do các đột biến mất đoạn lớn ở một hoặc cả hai gen alpha globin (HBA1 và HBA2), nằm song song trên nhiễm sắc thể 16 (hình 1). Với tổng số bình thường là bốn gen alpha globin, alpha thalassemia được phân loại rộng rãi dựa trên số lượng gen bị mất đoạn hoặc đột biến. Mất một và hai gen là phổ biến nhất và biểu hiện dưới dạng thể mang im lặng ($\alpha\alpha/-\alpha$) hoặc thể bệnh alpha thalassemia ($-\alpha/-\alpha, \alpha\alpha/–$).

Do tần suất cao, việc đồng di truyền các đột biến mất đoạn gen HBA1 hoặc HBA2 với các đột biến gen beta globin không phải là hiếm. Các đột biến mất đoạn lớn dẫn đến mất cả HBA1 và HBA2 trên cùng một nhiễm sắc thể rất phổ biến ở những người có tổ tiên Đông Nam Á (nhưng không độc quyền), và khi những trường hợp mất đoạn lớn này được đồng di truyền với một đột biến mất đoạn gen alpha đơn lẻ từ cha hoặc mẹ còn lại, kết quả sẽ gây ra bệnh Hb H (tổng cộng ba gen bị mất đoạn hoặc biến thể gây bệnh; $-\alpha/–$). Huyết sắc tố H là một thể tetramer bao gồm bốn chuỗi beta globin. Sự di truyền đồng hợp tử các đột biến mất đoạn lớn liên quan đến cả hai gen alpha globin (nghĩa là mất cả bốn gen alpha) dẫn đến bệnh alpha thalassemia đồng hợp tử hoặc “phù thai.” (Xem “Sinh lý bệnh của thalassemia”).

Thalassemia rất phức tạp về mặt di truyền và không đồng nhất; cách phân loại trên đây mang tính đơn giản hóa. Một số nguyên nhân khác gây thalassemia bao gồm các biến thể dẫn đến cấu trúc Hb bị thay đổi. Một ví dụ là Hb Lepore, một dạng Hb lai trong đó trình tự chuỗi $\delta$-globin ở đầu 5′ nối với trình tự chuỗi $\beta$-globin ở đầu 3′ kèm theo mất đoạn DNA giữa các gen, điều này đặt gen lai $\delta\beta$ dưới sự kiểm soát phiên mã của promoter $\delta$-globin kém hoạt động, gây ra sự biểu hiện thấp của globin lai. Các ví dụ về đột biến tạo ra sự thay đổi axit amin và vị trí cắt nối bất thường bao gồm Hb E, Hb Knossos và Hb Malay; các đột biến này gây ra cả bất thường về định tính và định lượng. Các loại đột biến khác gây ra các globin “siêu bất ổn định”, trong đó các chuỗi globin mới hình thành có tính không ổn định cao và nhanh chóng bị phân giải bởi protease, dẫn đến một rối loạn định lượng (mang tính thalassemia) thứ phát 1-4. (Xem “Các biến thể huyết sắc tố bao gồm Hb C, Hb D và Hb E”).

Các biến thể gây bệnh hoặc mất đoạn ở gen gamma, delta và các gen globin khác cũng có thể dẫn đến một phổ rối loạn từ tình trạng di truyền sự biểu hiện Hb bào thai (HPFH) lành tính trên lâm sàng đến bệnh thalassemia delta-beta ($\delta\beta$) có triệu chứng. (Xem “Chẩn đoán thalassemia (người lớn và trẻ em)” và “Huyết sắc tố bào thai (Hb F) trong sức khỏe và bệnh lý”).

Sàng lọc ban đầu đối với bệnh thalassemia có thể được thực hiện bằng các phương pháp dựa trên protein, có thể cho thấy những thay đổi về tỷ lệ các Hb bình thường (ví dụ: tăng Hb F hoặc $\text{Hb A}_2$) hoặc sự hiện diện của các Hb bất thường (ví dụ: Hb Barts, Hb E); tuy nhiên, việc xác định chẩn đoán alpha và beta thalassemia đòi hỏi phải phân tích DNA. (Xem ‘Phương pháp di truyền phân tử (dựa trên DNA)’ dưới đây).

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HIỆN CÓ

Tổng quan về các phương pháp

Các phương pháp phân tích huyết sắc tố (Hb) không ngừng tiến bộ, và hiện có sẵn một số kỹ thuật thích hợp thường quy dùng để phát hiện bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy) 5. Các phương pháp này nhìn chung có thể được chia thành nhóm dựa trên protein (hóa học protein) và nhóm dựa trên DNA (di truyền phân tử). Bảng tổng quan về ưu và nhược điểm của các cách tiếp cận này được trình bày trong bảng (bảng 1).

Trước đây, các phương pháp điện di trên nền gel được sử dụng để đánh giá nhiều bệnh lý huyết sắc tố phổ biến. Điện di có thể tách được nhiều loại Hb bình thường và bất thường, chẳng hạn như Hb A, Hb A2, Hb F, Hb S và Hb C. Điện di trên nền gel vẫn được sử dụng thường quy tại nhiều phòng thí nghiệm; tuy nhiên, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản vùng (CZE) và sắc ký hội tụ đẳng điện (IEF) ngày càng trở thành các phương pháp đầu tay được ưu tiên lựa chọn.

HPLC và CZE là những kỹ thuật được áp dụng phổ biến nhất tại các phòng thí nghiệm có công suất lớn nhờ khả năng xử lý số lượng mẫu lớn trong thời gian tương đối ngắn.

Thông tin từ tiền sử gia đình và xét nghiệm của bố mẹ — bao gồm công thức máu toàn bộ (CBC), số lượng hồng cầu lưới và hình thái máu ngoại vi — kết hợp với một hoặc nhiều phương pháp dựa trên protein, thường là đủ để chẩn đoán các biến thể Hb phổ biến, nhưng không phải lúc nào cũng vậy. Các phương pháp dựa trên DNA có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh alpha-thalassemia và beta-thalassemia. Trên thực tế, chúng có giá trị ứng dụng lâm sàng cao đối với việc chẩn đoán tất cả các loại bệnh lý huyết sắc tố (cả thể thalassemia và các biến thể cấu trúc).

Các phương pháp hóa học protein

Tổng quan về các phương pháp hóa học protein

Các phương pháp dựa trên protein vẫn là lựa chọn hàng đầu trong phân tích định tính và định lượng huyết sắc tố (Hb) ban đầu (gồm tỷ lệ các loại Hb khác nhau, xác định các biến thể Hb, và định lượng tuyệt đối hàm lượng Hb A2 và Hb F).

Nhiều kỹ thuật hóa học protein đang được áp dụng thường quy tại các phòng xét nghiệm lâm sàng, bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao không đảo pha (NPLC), điện di mao quản vùng (CZE), điện di điểm đẳng điện (IEF), cùng với điện di gel trong môi trường kiềm và axit. Phần lớn các phòng xét nghiệm sử dụng một trong các phương pháp này làm bước đầu để nhận diện biến thể Hb, sau đó kết hợp kỹ thuật dựa trên protein thứ hai và đôi khi là thứ ba để xác nhận kết quả bất thường từ lần xét nghiệm đầu tiên (bảng 1).

Kết quả của tất cả các phương pháp phân tích protein đều có thể bị ảnh hưởng bởi việc truyền máu trước đó; do đó, cần khoảng thời gian trên 3 tháng kể từ lần truyền máu cuối cùng để có thể xác định chính xác kiểu hình Hb nội sinh của bệnh nhân.

Các hình ảnh dưới đây minh họa một số kết quả điển hình:

Khi trả kết quả, đặc biệt trong chương trình sàng lọc huyết sắc tố ở trẻ sơ sinh, các loại Hb phát hiện được thường được liệt kê theo thứ tự hàm lượng giảm dần (từ lượng cao nhất đến thấp nhất). Ví dụ cụ thể:

  • “AS” biểu thị lượng Hb A lớn hơn lượng Hb S, phù hợp với thể trạng hồng cầu hình liềm (sickle cell trait).
  • “SA” biểu thị lượng Hb S lớn hơn lượng Hb A, phù hợp với bệnhthalassemia thể bê-ta dương tính (sickle-beta+ thalassemia).

Bên cạnh đó, tỷ lệ tương đối (tính bằng phần trăm) của từng loại Hb cũng cần được ghi nhận trong báo cáo kết quả.

Những ưu điểm nổi bật của HPLC và CZE bao gồm khả năng phân giải xuất sắc các phân khúc Hb (cả Hb bình thường lẫn biến thể), độ lặp lại cao, khả năng tự động hóa, chỉ cần thể tích mẫu máu rất nhỏ và thời gian trả kết quả nhanh chóng. NhChính những ưu điểm này đã thúc đẩy việc ứng dụng rộng rãi các kỹ thuật này trên lâm sàng. NPLC và CZE có thể đóng vai trò là các phương pháp bổ trợ lẫn nhau để giải quyết các trường hợp kết quả còn mơ hồ; những dạng Hb mà phương pháp này không phát hiện được có thể được phân giải bằng phương pháp kia. Trong khi đó, IEF và điện di gel có độ định lượng kém hơn, do đó ít hữu ích hơn trong việc đo lường chính xác các loại Hb có nồng độ thấp. Tuy nhiên, các phương pháp này lại thể hiện rất tốt vai trò trong việc nhận diện một số bệnh lý huyết sắc tố phổ biến.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng trao đổi cation (HPLC) tách được nhiều loại hemoglobin (Hb) bình thường và bất thường, bao gồm các Hb A, A2, F, S, C, O-Arab, D-Punjab và G-Philadelphia (hình 4, hình 5 và hình 6).

Phương pháp HPLC cho phép định danh giả định nhiều biến thể Hb hơn so với các phương pháp điện di dựa trên gel (nhưng kém hơn điện di mao quản – CZE). HPLC có thể định lượng các biến thể bình thường và bất thường, tích hợp nội kiểm tra (internal control) cho các biến thể phổ biến nhất, đồng thời kết quả có thể được so sánh với thư viện tham chiếu có sẵn về các biến thể ít gặp (thời gian lưu của một loại Hb bất kỳ có thể khác nhau giữa các hệ thống HPLC, do đó cần tham khảo tài liệu hướng dẫn cụ thể của nhà sản xuất để định danh Hb).

Trong HPLC, các Hb được rửa giải tách biệt với tốc độ phụ thuộc vào ái lực của chúng đối vói cột, sau đó được phát hiện bằng quang kế. Các biểu đồ rửa giải thu được (các đỉnh Hb) được thể hiện đồ họa trong các “cửa sổ” xác định dựa trên thời gian xuất hiện tương đối của chúng trong dịch rửa giải (thời gian lưu). Thời gian lưu của các biến thể Hb khác nhau sẽ khác nhau tùy thuộc vào thiết bị và phần mềm HPLC được sử dụng (cần tham khảo tài liệu tham khảo riêng của nhà sản xuất cho từng thiết bị để định danh các biến thể Hb dựa trên thời gian lưu). Tỷ lệ tương đối của các phân fração Hb có thể được định lượng bằng cách tính diện tích dưới đường cong cho mỗi đỉnh.

HPLC là phương pháp ưu tiên để xác định bệnh thalassemia dạng beta vì phương pháp này định lượng chính xác Hb A2 và Hb F. HPLC cũng phù hợp cho công tác sàng lọc cộng đồng đối với các bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy) nhờ khả năng tự động hóa cao. Một ví dụ điển hình là sàng lọc sơ sinh, đặc biệt ở các quần thể có tần suất mắc bệnh beta thalassemia hoặc alpha thalassemia cao. HPLC rất phù hợp để phát hiện người mang gen (carrier) beta thalassemia vì có thể dễ dàng định lượng Hb A2 và Hb F. Phương pháp này cũng rất hiệu quả trong các trường hợp cần định lượng chính xác, chẳng hạn như đánh giá tỷ lệ phần trăm Hb S và Hb F ở bệnh nhân đang điều trị truyền máu hoặc dùng hydroxyurea do bệnh hồng cầu liềm. (Xem ‘Sàng lọc cộng đồng (ví dụ: sàng lọc sơ sinh thường quy)’ bên dưới).

Nhược điểm của HPLC bao gồm chi phí cao, đòi hỏi chuyên môn kỹ thuật, và hiện tượng chồng lấp (độ phân giải kém; thời gian lưu rất giống nhau hoặc trùng nhau) của một số loại Hb. Ví dụ, Hb E, Hb Korle-Bu và Hb Lepore đều có thể chồng lấp với Hb A2, do đó không thể định lượng chính xác từng phân đoạn riêng biệt. Nồng độ Hb A2 cũng có thể bị nhiễu tăng giả tạo khi có mặt Hb S (do các sản phẩm cộng hợp sau dịch mã của Hb S cùng rửa giải). Sự tách biệt của các Hb có thể thay đổi đôi chút tùy thuộc vào thiết bị, thuốc thử và chương trình được sử dụng cho hệ thống HPLC. Sự hiện diện của các Hb bị glycosyl hóa, acetyl hóa hoặc các yếu tố nhiễu (artifact) có thể tạo ra các biểu đồ phức tạp, đòi hỏi nhân viên xét nghiệm có kinh nghiệm trực tiếp đọc và biện luận kết quả.

Thay vì tách các tetramer Hb nguyên vẹn, HPLC trao đổi cation (và các kỹ thuật điện di được thảo luận ở phần tiếp theo) phân tách các loại Hb dưới dạng các dimer (dimer alpha:beta và alpha:gamma). Để tách riêng biệt từng monomer globin alpha, beta, gamma và các loại khác, có thể sử dụng phương pháp HPLC pha đảo (reverse-phase HPLC). Phương pháp này gọi là tách chuỗi globin. Việc tách chuỗi globin có thể hữu ích trong việc khảo sát một số dạng HPFH không do mất đoạn (nhằm xác định tỷ lệ tương đối của các chuỗi globin Gγ và Aγ) hoặc các Hb biến đổi gen (ví dụ: Hb AT87Q). (Xem “Hemoglobin bào thai (Hb F) ở trạng thái bình thường và bệnh lý”, mục ‘Hội chứng tăng persistencia hemoglobin bào thai di truyền (HPFH)’).

Điện di vùng mao quản

Điện di vùng mao quản (CZE) có thể được sử dụng làm xét nghiệm đầu tay trong chẩn đoán các bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy), sàng lọc sơ sinh, hoặc đóng vai trò là phương pháp bổ trợ nhằm phát hiện, định lượng các huyết sắc tố bất thường và làm rõ các kết quả chưa rõ ràng từ các phương pháp dựa trên protein khác. Kỹ thuật CZE có thể thực hiện trên dung dịch hồng cầu ly giải từ mẫu máu thấm khô trên giấy lọc, máu cuống rốn hoặc máu toàn phần, nhờ đó mang lại tiềm năng ứng dụng cao trong chương trình sàng lọc sơ sinh.

CZE có độ phân giải, khả năng định lượng các huyết sắc tố có nồng độ thấp, mức độ tự động hóa và tốc độ tương đương với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (có thể chạy nhiều mẫu cùng lúc với thời gian hoàn thành 8 phút cho mỗi lần chạy). Ưu điểm của CZE là ít chịu nhiễu từ các chuỗi globin biến đổi sau dịch mã (chẳng hạn như dạng gắn đường – glycated). Bên cạnh đó, CZE là phương pháp được ưu tiên lựa chọn để chẩn đoán xác định bệnh thalassemia kiểu gen beta nhờ khả năng định lượng chính xác Hb A2 và Hb F. Phương pháp này cũng tách biệt hoàn toàn Hb E và Hb A2, đồng thời không bị ảnh hưởng bởi các sản phẩm cộng hợp của Hb S, cho phép định lượng chính xác cả hai thành phần này (khác với phương pháp HPLC).

CZE là một dạng điện di sử dụng dung dịch đệm lỏng thay vì bản gel để phân tách và định lượng các huyết sắc tố bình thường cũng như bất thường. Các biến thể huyết sắc tố được tách dựa trên dòng điện thẩm thấu (electro-osmotic flow), sử dụng các mao quản silica mang điện tích âm và dòng điện cao áp. Biểu đồ thu được sẽ chia thành 15 vùng, trong đó các huyết sắc tố bình thường và biến thể hiển thị dưới dạng các đỉnh (peak) và có thể được định lượng (hình 7). Thời gian di chuyển và các vùng này được dùng để định danh huyết sắc tố, tương tự như thời gian lưu và các “cửa sổ” trong sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

Nhược điểm của CZE bao gồm chi phí cao, đòi hỏi kỹ thuật viên có chuyên môn và khả năng tách chưa hoàn toàn giữa Hb S và Hb D.

Ví dụ về các phương pháp bổ trợ bao gồm: sử dụng CZE để giải quyết tình trạng tăng giả tạo nồng độ Hb A2 do sự hiện diện của Hb S khi đo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, hoặc sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân giải các huyết sắc tố có cùng vùng di chuyển với Hb A trên bản điện di CZE.

Điện di điểm đẳng điện (Isoelectric focusing)

Điện di điểm đẳng điện (IEF) là phương pháp phổ biến giúp định tính các hemoglobin (Hb) bất thường nhờ độ chính xác và độ tin cậy cao (vượt trội hơn điện di gel thông thường). Phương pháp IEF phát hiện các loại Hb S, C, E, A2, Hb D-Punjab (Hb D-LA) và Hb G-Philadelphia. Bên cạnh đó, IEF còn có khả năng nhận diện các dạng Hb di chuyển nhanh vốn là đặc trưng của bệnh alpha thalassemia như Hb H (thể bốn chuỗi beta globin, b4) và Hb Barts (thể bốn chuỗi gamma globin, γ4), điều này giúp phương pháp này trở nên đặc biệt hữu ích trong sàng lọc sơ sinh. (Xem thêm mục ‘Sàng lọc quần thể (ví dụ: sàng lọc thường quy ở trẻ sơ sinh)’ dưới đây).

IEF là một kỹ thuật vững chắc với nền tảng công nghệ tương đối đơn giản, không đòi hỏi chuyên môn phòng thí nghiệm quá cao. Do đó, đây là phương pháp chẩn đoán ưu tiên, đặc biệt trong công tác sàng lọc sơ sinh tại các cơ sở y tế có nguồn lực hạn chế so với phương pháp HPLC hay CZE.

IEF là kỹ thuật điện di dùng để tách các loại Hb dựa trên điện tích ròng của chúng trong một gradient độ pH trên môi trường gel (ví dụ: polyacrylamide, agarose lớp mỏng). Các phân tử Hb di chuyển qua gradient độ pH cho đến điểm mà điện tích ròng của chúng bằng không (tức là điểm đẳng điện [pI]) (xem hình 8 và hình 9). Sơ đồ di chuyển Hb của IEF có nhiều điểm tương đồng với điện di gel kiềm, nhưng có ưu điểm là phân giải được Hb C ra khỏi Hb E và Hb O, cũng như Hb S ra khỏi Hb D và Hb G. Thêm vào đó, Hb A và Hb F cũng được phân tách rõ ràng.

Nhược điểm của IEF là không thể dùng để phân biệt giữa Hb E với Hb C-Harlem hoặc Hb O-Arab, đồng thời không phân biệt được Hb G-Philadelphia với Hb Lepore. Phương pháp quét quang mật độ (scanning densitometry) trên bản gel có thể được áp dụng để đo lường bán định lượng kích thước các băng, tuy nhiên độ chính xác chưa đủ cao để định lượng chính xác các thành phần Hb có nồng độ thấp như Hb A2. Vì vậy, IEF không hữu ích bằng phương pháp HPLC hoặc CZE trong việc xét nghiệm sàng lọc ban đầu và thường quy ở người trưởng thành.

Điện di trên nền gel

Mặc dù đã có những tiến bộ kỹ thuật với các phương pháp mới hơn (như HPLC, CZE), nhiều phòng xét nghiệm quy mô nhỏ vẫn tiếp tục sử dụng phương pháp điện di trên gel làm xét nghiệm ban đầu để chẩn đoán các rối loạn huyết sắc tố (hemoglobin). Kỹ thuật này có khả năng tách các loại huyết sắc tố bình thường bao gồm Hb A, Hb A2 và Hb F, cùng một số loại huyết sắc tố biến thể như Hb S và Hb C. Nhờ tính đơn giản và chi phí thấp, điện di gel vẫn giữ được ưu thế trong một số điều kiện lâm sàng nhất định. Tuy nhiên, đối với công tác sàng lọc đầu tay các bệnh lý huyết sắc tố, điện di gel phần lớn đã được thay thế tại các phòng xét nghiệm hiện đại bằng các phương pháp nhạy bén hơn, đáng tin cậy hơn và có khả năng tự động hóa cao như CZE và HPLC kết hợp với IEF.

Điện di là phương pháp kinh điển dùng để phân tách các protein huyết sắc tố dựa trên điện tích ròng của chúng. Một điện trường được đặt vào môi trường gel ở một mức pH xác định. Quá trình điện di có thể được thực hiện ở môi trường pH kiềm (trên nền cellulose acetate) hoặc môi trường pH acid (trên nền thạch citrate). Ở môi trường pH kiềm, các phân tử huyết sắc tố mang điện tích âm thuần lớn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn về phía cực dương của điện trường (hình 10). Kỹ thuật quét quang mật độ (scanning densitometry) trên bản gel có thể được áp dụng để ước tính bán định lượng kích thước của các vạch phân tách.

Tuy nhiên, phương pháp điện di trên gel vẫn tồn tại một số nhược điểm:

  • Ở môi trường pH kiềm, kỹ thuật này không thể phân biệt được các loại huyết sắc tố có cùng tốc độ di chuyển và vị trí, chẳng hạn như nhóm Hb A2, Hb C, Hb E và Hb O; hoặc việc tách biệt giữa Hb D, Hb G và Hb S.
  • Việc phân tách các huyết sắc tố đồng di cư có thể thực hiện được ở môi trường pH acid (ví dụ: tách Hb C và Hb O ra khỏi Hb E và Hb A2; tách Hb S ra khỏi Hb D và Hb G). Mặc dù vậy, hệ thống vẫn không thể phân biệt rạch ròi giữa Hb E và Hb A2, hay tách biệt giữa Hb D và Hb G.
  • Phương pháp này không cho phép định lượng chính xác các biến thể huyết sắc tố có nồng độ thấp hoặc định lượng thành phần Hb A2 vốn chiếm tỷ lệ nhỏ ở người trưởng thành.
  • Việc phát hiện các biến thể huyết sắc tố di chuyển nhanh thường gặp trong bệnh lý alpha thalassemia (như Hb H và Hb Barts) gặp nhiều khó khăn.
  • Kỹ thuật này đòi hỏi các Thao tác thủ công nên không phù hợp cho việc phân tích số lượng lớn mẫu bệnh phẩm trong cùng một thời điểm (high-throughput analysis).

Phổ khối lượng

Phổ khối lượng (Mass spectrometry – MS) cũng đang được nghiên cứu và ứng dụng trong công tác sàng lọc sơ sinh hoặc chẩn đoán các bệnh lý huyết sắc tố. Hiện có nhiều kỹ thuật phổ khối lượng khác nhau, tất cả đều có thể được ứng dụng để suy luận chuỗi acid amin (cả dạng bình thường và dạng biến thể) của các chuỗi globin quan tâm. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi chuyên môn kỹ thuật cao và đôi khi cần đến các trang thiết bị được thiết kế riêng biệt.

Các phương pháp di truyền phân tử (dựa trên DNA)

Tổng quan về các phương pháp dựa trên DNA

Vai trò của xét nghiệm di truyền

Các phương pháp dựa trên nền tảng DNA hiếm khi được sử dụng như một xét nghiệm sàng lọc bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy), mặc dù vai trò của xét nghiệm DNA bước đầu đang dần có sự chuyển biến. Việc tích hợp xét nghiệm DNA vào thực hành thường quy như một phương pháp xét nghiệm tuyến hai đang dần trở thành tiêu chuẩn chăm sóc y tế.

Xét nghiệm di truyền không phải là một kỹ thuật đơn lẻ; mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và hạn chế riêng. Đối với tất cả các kỹ thuật di truyền, bác sĩ lâm sàng cần nắm rõ nguyên lý của từng phương pháp để có thể giải thích kết quả một cách chính xác.

Đối với các bệnh lý huyết sắc tố, việc chỉ thực hiện giải trình tự gene đôi khi là chưa đủ, và phân tích biến thể số lượng bản sao (copy number variation – CNV) thường là rất cần thiết. Ví dụ, phân tích trình tự gene đơn thuần sẽ không phát hiện được các đoạn mất đoạn lớn (chẳng hạn như hiện tượng bán hợp tử đối với đột biến Hb S, tương tự trong trường hợp Hb S kết hợp mất đoạn gene HPFH, khi phân tích trình tự gene sẽ cho kết quả nhầm lẫn là đồng hợp tử đột biến Hb S, mặc dù hai tình trạng này hoàn toàn khác biệt và việc phân biệt chúng có ý nghĩa quan trọng đối với công tác tư vấn di truyền cũng như các khía cạnh quản lý điều trị khác).

Hơn nữa, việc phân tích cả hai locus gene alpha và beta globin (bao gồm cả phân tích trình tự gene và phân tích biến thể số lượng bản sao của cả hai locus này) thường là bắt buộc để giải thích, dự đoán hoặc thấu hiểu kiểu hình bệnh lý. Trên thực tế, rất khó để xác định trước từ đầu những bệnh nhân nào “cần” xét nghiệm di truyền (hoặc loại xét nghiệm di truyền nào là phù hợp), điều này củng cố quan điểm nên áp dụng xét nghiệm di truyền toàn diện cho tất cả bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh lý huyết sắc tố.

Các lưu ý về kỹ thuật

Thay vì dựa vào thành phần acid amin của protein globin, xét nghiệm DNA (hay còn gọi là kiểu gen hoặc xét nghiệm di truyền phân tử) xác định trình tự nucleotide của một hoặc nhiều gen globin, cũng như sự hiện diện của các biến thể số lượng bản sao (ví dụ: mất đoạn, lặp đoạn) và các tái sắp xếp phức tạp. Các xét nghiệm này phân tích DNA trong bạch cầu (WBC), vốn mang toàn bộ trình tự DNA dòng tế bào mầm của cá thể, thay vì hồng cầu (RBC) do tế bào này không có nhân. Có nhiều phương pháp sẵn có và việc phân tích một hoặc nhiều gen cùng lúc là khả thi, tùy thuộc vào phương pháp và trang thiết bị được sử dụng (
bảng 1
).

Các phương pháp phân tử đặc biệt hữu ích để chẩn đoán xác định các bệnh lý có ý nghĩa lâm sàng ở bệnh nhân nghi ngờ mắc thalassemia, cũng như trong tầm soát trước sinh và trẻ sơ sinh.

Ưu điểm tiềm năng của xét nghiệm DNA ở trẻ sơ sinh bao gồm khả năng xác định các khiếm khuyết trong chuỗi globin trước khi các chuỗi này được biểu hiện (ví dụ: xác định các khiếm khuyết gen beta globin trong giai đoạn đầu đời, khi chuỗi beta-like chủ đạo vẫn chưa chuyển từ gamma globin sang beta globin) (
hình 2
). Ngược lại, chẩn đoán bằng các phương pháp dựa trên protein có thể đòi hỏi phải chờ đợi đến khi trẻ được 3 tháng tuổi trở lên, thời điểm các Hb người lớn chiếm ưu thế. Việc phát hiện sớm thalassemia trong các trường hợp này mang lại cơ hội chẩn đoán và can thiệp điều trị phù hợp ngay từ giai đoạn sớm. Phân tích dựa trên DNA đã cho thấy giá trị lâm sàng như một thành phần trong tầm soát sơ sinh đối với bệnh hồng cầu hình liềm (SCD)
6,7.

Các ưu điểm khác của xét nghiệm dựa trên DNA bao gồm thời gian trả kết quả nhanh (tính bằng giờ) đối với một số phương pháp, độ tin cậy cao, khả năng tự động hóa, chi phí liên tục giảm và các quy trình không ngừng được cải tiến. Ngoài ra, việc áp dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) và lai so sánh hệ gen trên chip (array CGH) có thể cho phép tầm soát rộng rãi nhiều bệnh huyết sắc tố cùng một lúc
6-9. (Xem
‘Lai so sánh bộ gen vi mạch (Array CGH)’ bên dưới và
‘NGS’ bên dưới.)

Có một số tình huống mà các kỹ thuật phân tử đặc biệt hữu ích:

  • Ở trẻ sơ sinh có kết quả tầm soát ban đầu:
    • Chỉ có Hb F: nhằm xác định và phân biệt giữa beta 0 thalassemia (thalassemia phụ thuộc truyền máu [TDT]) với tình trạng tồn tại di truyền Hb bào thai đồng hợp tử (HPFH).
    • Có Hb FE: nhằm phân biệt giữa Hb E/beta 0 thalassemia với Hb EE.
    • Có Hb Barts (tetramer của các chuỗi gamma globin) với tỷ lệ >25% tổng lượng Hb: nhằm xác định kiểu gen đặc hiệu của alpha thalassemia (bệnh Hb H, Hb H-Constant Spring, và các thể khác).
  • Nếu xét nghiệm tầm soát mang gen trước sinh của một trong hai cha mẹ gợi ý alpha hoặc beta thalassemia, bao gồm một hoặc nhiều dấu hiệu sau:
    • Các chỉ số hồng cầu cho thấy hồng cầu nhỏ hoặc nhược sắc (ví dụ: thể tích trung bình hồng cầu [MCV] <80 fL hoặc lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu [MCH] <27 pg).
    • Hb A 2 tăng (>3,5%) hoặc Hb F tăng (>5%).
  • Nếu bệnh nhân đang được đánh giá về bệnh huyết sắc tố và các phương pháp dựa trên protein cho kết quả biến thể lạ hoặc không rõ ràng: các phương pháp dựa trên DNA có thể được sử dụng để xác định khiếm khuyết di truyền cụ thể. (Xem
    ‘Bệnh nhân có biến thể chưa rõ ý nghĩa’ bên dưới.)
  • Nếu bệnh nhân đang được đánh giá để chẩn đoán khả năng mắc thalassemia: bao gồm các thể dị hợp tử, đồng hợp tử, dị hợp tử kép với một đột biến thalassemia khác hoặc một biến thể Hb, và cần có chẩn đoán xác định. (Xem
    ‘Bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh thalassemia’ bên dưới.)

Việc lựa chọn phương pháp xét nghiệm DNA phụ thuộc vào loại biến thể nghi ngờ. Giải trình tự truyền thống (Sanger) và phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đặc hiệu alen được sử dụng để phát hiện các đột biến điểm và đánh giá các đột biến tại điểm gãy khi đã xác định được mất đoạn. Gap-PCR, khuếch đại đa mồi phụ thuộc gắn kết (MLPA) và lai so sánh hệ gen trên chip (aCGH) được sử dụng để phát hiện các biến thể số lượng bản sao như mất đoạn, lặp đoạn và gen dung hợp.

Tất cả các phương pháp dựa trên DNA có thể thực hiện trên DNA từ bạch cầu máu ngoại vi. Đối với chẩn đoán trước sinh, có thể sử dụng tế bào dịch ối hoặc mẫu gai nhau. DNA thường được khuếch đại bằng PCR (xem
“Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)”) và sau đó xác định kiểu gen để đưa ra chẩn đoán xác định. Việc sử dụng các phương pháp này trên DNA tự do của thai nhi trong máu mẹ để chẩn đoán bệnh huyết sắc tố vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu. (Xem
“Sàng lọc trước sinh đối với các bất thường nhiễm sắc thể phổ biến ở thai nhi: Xét nghiệm DNA tự do trong huyết tương”.)

Xét nghiệm dựa trên DNA có một số hạn chế chung, tùy thuộc vào phương pháp cụ thể được sử dụng. Ví dụ, một số phương pháp giải trình tự và PCR có thể không xác định được các mất đoạn gen lớn do thiếu vị trí bắt cặp của mồi (primer annealing sites). Vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách thực hiện xét nghiệm sàng lọc ban đầu ở cấp độ protein (CZE, NPLC, hoặc IEF) hoặc sử dụng các phương pháp DNA được thiết kế chuyên biệt để phát hiện các mất đoạn lớn (xem
‘Gap-PCR và MLPA’ bên dưới và
‘Lai so sánh bộ gen vi mạch (Array CGH)’ bên dưới). Các vị trí bắt cặp của mồi cũng có thể đa hình, dẫn đến thất bại trong quá trình khuếch đại. Nếu nghi ngờ tình trạng này, có thể sử dụng các cặp mồi thay thế. Một nhược điểm khác của các phương pháp dựa trên DNA là chi phí trang thiết bị và hóa chất vẫn cao hơn đáng kể so với hầu hết các kỹ thuật dựa trên protein.

Giải trình tự DNA truyền thống và PCR đặc hiệu alen

Giải trình tự DNA giúp xác định thứ tự các nucleotide của một hoặc nhiều gen. Phương pháp giải trình tự truyền thống (Sanger) là tiêu chuẩn vàng và thường được áp dụng khi nghi ngờ một thể biến dị globin cụ thể dựa trên xét nghiệm sàng lọc ban đầu hoặc tiền sử gia đình. Trong trường hợp này, xét nghiệm có thể được khu trú vào một hoặc nhiều gen globin chịu ảnh hưởng, như minh họa trong hình (hình 11). Tuy nhiên, kiểu hình của các bệnh lý huyết sắc tố nói chung và bệnh thalassemia nói riêng được quyết định bởi sự tương tác của cả hai cụm gen alpha globin và beta globin, do đó một chẩn đoán xác định, chính xác thường đòi hỏi phải đánh giá cả hai locus gen.

Các xét nghiệm đặc hiệu alen được sử dụng để xác định sự hiện diện hoặc vắng mặt của một alen cụ thể. Kỹ thuật PCR đặc hiệu alen sử dụng một bộ mồi oligonucleotide tổng hợp có khả năng lai ghép và khu biệt đặc hiệu các trình tự DNA mang alen quan tâm (ví dụ: Hb A, Hb S, Hb C, Hb D, Hb E và Hb O-Arab). Các sản phẩm PCR có thể được phân tích bằng điện di dựa trên kích thước của các đoạn DNA được tạo thành. Ngoài ra, các enzyme cắt giới hạn có thể được dùng để cắt DNA tại các trình tự đặc hiệu chỉ xuất hiện ở một số biến dị nhất định, tiếp theo là điện di sản phẩm cắt; phương pháp này được gọi là phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP).

Phương pháp giải trình tự Sanger cũng có thể được ứng dụng để tầm soát các đột biến điểm gây ra các biến dị huyết sắc tố phổ biến nhất và các kiểu gen beta thalassemia. Kỹ thuật này sử dụng hệ thống 96 giếng tự động, kết hợp các đoạn PCR gối đầu (overlapping) và mồi gắn thẻ phổ quát. Các kỹ thuật sàng lọc này chỉ phát hiện được nhóm đột biến huyết sắc tố mà chúng được thiết kế để nhắm tới, vì vậy các kết quả âm tính hoặc bình thường cần được diễn giải một cách thận trọng.

Giải trình tự Sanger có thể xác định toàn bộ trình tự mã hóa (cũng như các vùng điều hòa/không mã hóa quan trọng) của bất kỳ gen globin và vùng enhancer nào. Phương pháp này giúp chẩn đoán xác định mọi bệnh lý huyết sắc tố do đột biến điểm hoặc các đoạn chèn/mất đoạn kích thước nhỏ. Việc phân tích đồng thời biến động số lượng bản sao (mất đoạn/lặp đoạn) đóng vai trò hỗ trợ đắc lực, bởi vì các trường hợp mất đoạn lớn, lặp đoạn và các tái sắp xếp cấu trúc khác thường là nguyên nhân dẫn đến các bệnh lý huyết sắc tố.

Gap-PCR và MLPA

Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase dạng khoảng trống (Gap-polymerase chain reaction – gap-PCR) được áp dụng để tầm soát các đột biến mất đoạn lớn trên gen alpha globin hoặc beta globin vốn không thể phát hiện bằng phương pháp giải trình tự DNA (do một hoặc cả hai vị trí bám mồi bị mất đoạn). Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc phát hiện các mất đoạn alpha thalassemia thường gặp.

Gap-PCR là một biến thể của PCR, nhưng khác với PCR dùng trong giải trình tự gen, kỹ thuật này nhằm xác định các điểm đứt gãy mất đoạn. Quá trình này sử dụng các mồi PCR nằm ở hai bên của điểm đứt gãy mất đoạn đã biết thay vì bám vào trình tự gen bình thường. Do đó, mồi chỉ tạo ra sản phẩm khuếch đại khi DNA của bệnh nhân mang trình tự đặc hiệu của đoạn gen bị mất đó. Ví dụ phổ biến nhất là bệnh alpha thalassemia, trong đó các mồi đặc hiệu cho các dạng mất đoạn thường gặp có thể được kết hợp với nhau; một ví dụ được minh họa trong (hình 12).

Gap-PCR cũng thường quy được sử dụng để phát hiện các mất đoạn trên gen delta và beta globin dẫn đến biến thể lai delta/beta được gọi là Hb Lepore (xem ‘Các loại bất thường’ ở trên), cũng như các trường hợp mất đoạn gen globin gây hội chứng bền hemoglobin bào thai (HPFH) và nhân đôi gen alpha globin. Các sản phẩm của gap-PCR được phân tích bằng điện di trên gel và so sánh với các mẫu chứng dương tính đã biết; sự xuất hiện của vạch bất thường trên gel cho thấy cá thể đó mang đoạn mất đoạn cụ thể.

Tuy nhiên, Gap-PCR ít có giá trị trong việc đánh giá các trường hợp mất đoạn thalassemia bất thường hoặc chưa được mô tả đặc tính, vì phương pháp này chỉ phát hiện được những trường hợp đã biết rõ điểm đứt gãy.

Gap-PCR không thể phát hiện tình trạng nhân ba gen alpha (và các dạng tăng số lượng bản sao bậc cao hơn), vốn có thể tác động lớn đến kiểu hình lâm sàng (bệnh nhân dị hợp tử beta thalassemia kèm theo nhân ba gen alpha có thể xuất hiện tình trạng thiếu máu có ý nghĩa lâm sàng).

Kỹ thuật khuếch đại đầu dò phụ thuộc vào sự nối đa mồi (Multiplex ligation-dependent probe amplification – MLPA) ngày càng được ứng dụng rộng rãi để phát hiện các mất đoạn và nhân đoạn lớn trong các gen globin, với các chỉ định tương tự như gap-PCR. Tuy nhiên, khác với gap-PCR (vốn chỉ nhận diện được những mất đoạn đã biết rõ điểm đứt gãy), MLPA còn có thể xác định cả những trường hợp mất đoạn chưa rõ điểm đứt gãy, đặc biệt là các mất đoạn lớn trên gen alpha hoặc beta globin.

MLPA là một biến thể của PCR, trong đó một cặp đầu dò đã được nối (ligated probes) thay vì trình tự gen đích sẽ được khuếch đại bằng PCR. Một cặp đầu dò chỉ được khuếch đại khi chúng lai ghép ở vị trí đủ gần nhau trên gen đích ở DNA của bệnh nhân để enzyme DNA ligase có thể nối lại, và chúng chỉ có thể lai ghép sát nhau khi toàn bộ trình tự quan tâm được bảo toàn. Do đó, việc không tạo ra sản phẩm PCR cho thấy sự mất đoạn của một vùng DNA thuộc đoạn gen đó. Hơn nữa, định lượng tương đối của các sản phẩm PCR có thể giúp xác định xem đoạn mất đoạn đó là đồng hợp tử (vắng bóng sản phẩm) hay dị hợp tử (giảm 50% lượng sản phẩm). Tình trạng tăng số lượng bản sao cũng có thể được xác định bằng cách tương tự.

Một số bộ kit MLPA thương mại hiện nay còn tích hợp các đầu dò đặc hiệu cho các biến thể Hb S và Hb Constant Spring.

Mặc dù MLPA là công cụ sàng lọc mất đoạn hữu hiệu, phương pháp này không xác định chính xác vị trí điểm đứt gãy; nếu cần thiết, phải thực hiện giải trình tự truyền thống hoặc giải trình tự thế hệ mới (NGS). Việc xác định chính xác các điểm đứt gãy có ý nghĩa hỗ trợ tiên lượng kiểu hình và đánh giá xem bệnh nhân có mang đột biến mất đoạn mới xuất hiện (de novo) và/hoặc chưa từng được mô tả trước đây hay không.

Array CGH

Kỹ thuật lai so sánh hệ gen trên vi thể dạng mảng (Array-based comparative genomic hybridization – aCGH; còn gọi là kỹ thuật phủ mảng chi tiết – fine tiling array) là một phương pháp sinh học phân tử khác giúp xác định diện rộng các khiếm khuyết bệnh thalassemia trên cả hai gen globin alpha và beta.

Bên cạnh các đột biến điểm và các đoạn mất đoạn kích thước nhỏ, aCGH còn phát hiện được các biến dị số lượng bản sao (CNVs), đảo đoạn, chèn đoạn, mất đoạn và các tái cấu trúc phức tạp khác mà phần lớn các phương pháp giải trình tự DNA thông thường không thể phát hiện được.

Kỹ thuật aCGH chủ yếu được ứng dụng để mô tả đặc điểm của một đoạn mất đoạn đã được phát hiện trước đó bằng phương pháp MLPA. Ví dụ, khi MLPA xác định có tình trạng mất đoạn trên cụm gen alpha hoặc beta globin nhưng không thể xác định chính xác điểm đứt gãy (breakpoint).

Trong trường hợp này, aCGH có thể tiết kiệm thời gian và ít cồng kềnh hơn so với kỹ thuật gap-PCR khi cần mô tả các đoạn mất đoạn và lặp đoạn do tái tổ hợp gây ra (ví dụ: bệnh thalassemia thể delta-beta).

Trong xét nghiệm aCGH, DNA bộ gen của bệnh nhân sẽ được lai ghép trên một vi mảng (microarray) chứa từ hàng chục đến hàng trăm nghìn đầu dò oligonucleotide chồng lên nhau, mỗi đầu dò có chiều dài khoảng 60 đến 80 nucleotide.

Hiện nay đã có sẵn các vi mảng phủ chi tiết độ phân giải cao được thiết kế riêng cho chẩn đoán thalassemia, trong đó tập hợp các đầu dò đại diện cho phần lớn trình tự DNA nằm trong toàn bộ các cụm gen globin alpha, beta cũng như các vùng lân cận.

Do đó, aCGH có thể xác định bất kỳ khu vực nào của cả hai gen, bao gồm cả vùng mã hóa và vùng điều hòa (như các intron) ở trạng thái có mức độ bình thường, giảm, dư thừa hay hoàn toàn vắng mặt.

Những nhược điểm chính của aCGH bao gồm chi phí cao, đòi hỏi nhân sự được đào tạo chuyên sâu và thời gian trả kết quả kéo dài.

NGS

Giải trình tự thế hệ mới (Next-generation sequencing – NGS) là các kỹ thuật giải trình tự cho phép xác định đồng thời trình tự của nhiều đoạn DNA ngắn (“đọc”), từ đó giúp giải trình tự nhiều gen (hoặc toàn bộ exome, hay thậm chí toàn bộ bộ gen) một cách nhanh chóng và tiết kiệm chi phí hơn. Kỹ thuật NGS đang dần được ứng dụng trong xét nghiệm bệnh lý huyết sắc tố trên lâm sàng và xu hướng này dự kiến sẽ tiếp tục gia tăng. (Xem “Giải trình tự DNA thế hệ mới (NGS): Nguyên lý và ứng dụng lâm sàng”).

Một nền tảng NGS đang trong giai đoạn nghiên cứu bao phủ toàn bộ phổ đột biến gen beta-thalassemia đã biết cũng như các biến thể Hb phổ biến như Hb S, Hb C và Hb D, đã được phát triển để xét nghiệm 100 mẫu bệnh phẩm trong một lần chạy. Những ưu điểm tiềm năng của việc sử dụng NGS trong xét nghiệm huyết sắc tố bao gồm khả năng giải trình tự đồng thời tất cả các gen globin trong một xét nghiệm duy nhất, cùng với các gen khác điều hòa sự biểu hiện huyết sắc tố như BCL11A, MYB, KLF1 và GATA1. NGS có thể được thực hiện trên mẫu có kích thước nhỏ hơn so với phương pháp giải trình tự Sanger, đồng thời có tiềm năng tự động hóa và giảm thiểu công sức nhân công. Tuy nhiên, độ chính xác của NGS phụ thuộc vào nền tảng được sử dụng và độ sâu phủ (depth of coverage), và các kết quả từ NGS vẫn cần được xác nhận bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Một thách thức đặc biệt đối với NGS là sự hiện diện của các trình tự lặp lại, mất đoạn và các trình tự tương đồng rộng trong các cụm gen globin, đòi hỏi các đoạn đọc dài để xác định chính xác trình tự.

Xét nghiệm tại điểm chăm sóc (Point-of-care assays)

Các xét nghiệm tại điểm chăm sóc (Point-of-care – POC assays, còn gọi là xét nghiệm POCT) là các xét nghiệm có thể thực hiện trực tiếp tại nơi và thời điểm thăm khám bệnh nhân, đặc biệt hữu ích tại các khu vực không có điều kiện tiếp cận phòng xét nghiệm lâm sàng chuyên sâu. Phương pháp này tỏ ra vô cùng thiết thực tại các vùng còn hạn chế về nguồn lực nhưng có tỷ lệ mắc các bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy) cao, hoặc trong những tình huống đòi hỏi phải can thiệp y tế nhanh chóng.

Việc ứng dụng POCT để chẩn đoán bệnh hồng cầu liềm (SCD) và các rối loạn huyết sắc tố khác ở những vùng khan hiếm nguồn lực mang lại nhiều ưu điểm vượt trội:

  • Khả năng thông báo kết quả bất thường ngay cho phụ huynh hoặc người chăm sóc ngay tại thời điểm xét nghiệm, từ đó loại bỏ hoàn hảo công đoạn phải truy vết bệnh nhân sau đó để kết nối với hệ thống điều trị. (Xem thêm tại
    “Bệnh hồng cầu hình liềm ở khu vực cận Sahara thuộc Châu Phi”, phần ‘Xác định các cá thể mắc bệnh SCD’
    ).
  • Các xét nghiệm POCT đòi hỏi ít chuyên môn về kỹ thuật xét nghiệm và thường là dạng dùng một lần, không cần phải liên tục bổ sung hóa chất.
  • Hầu hết các POCT được thiết kế với chi phí thấp, cho phép triển khai rộng rãi ngay cả tại những khu vực có nguồn lực hạn chế nhất.

Mặc dù một số xét nghiệm POCT có thể mang lại kết quả chẩn đoán chính xác, những rào cản lớn đối với việc ứng dụng rộng rãi vẫn còn tồn tại, đồng thời nhu cầu cải thiện chất lượng chẩn đoán toàn cầu đối với bệnh hồng cầu liềm (SCD) và các rối loạn huyết sắc tố quan trọng về mặt lâm sàng vẫn là vô cùng cấp thiết.

Hiện nay có một số xét nghiệm POC cải tiến (
bảng 2
) phân tích các loại huyết sắc tố khác nhau. Các phương pháp này đã được thẩm định và đang được áp dụng trên toàn thế giới, chủ yếu nhằm chẩn đoán bệnh hồng cầu liềm (SCD)
10
. Các ví dụ tiêu biểu bao gồm:

Gazelle Hb Variant

– Gazelle Hb Variant là một thiết bị POC ứng dụng phiên bản thu nhỏ của phương pháp điện di trên giấy cellulose acetate đã mô tả ở trên. (Xem thêm
‘Điện di trên nền gel’
ở trên).

Thiết bị này có thể phát hiện và phân biệt các loại huyết sắc tố dựa vào quãng đường di chuyển của chúng từ điểm nhỏ mẫu (dựa vào điện tích), thông qua một quy trình gọi là “điện di vi mạch” (microchip electrophoresis)
10
. Một lượng máu nhỏ, thường lấy từ đầu ngón tay (hoặc gót chân), sẽ được xử lý trên một mẩu giấy cellulose trong dung dịch đệm kiềm được chứa bên trong một vi mạch nhựa chế tạo sẵn; tại đây, quá trình điện di cellulose acetate diễn ra dưới tác dụng của một điện trường chạy bằng pin để tách các huyết sắc tố (
hình 13
).

Hình ảnh kết quả điện di huyết sắc tố được ghi lại bằng một máy đọc cầm tay để phân tích theo thời gian thực (trong vòng 8 phút), bao gồm cả việc định lượng tỷ lệ phần trăm của từng loại huyết sắc tố có trong mẫu. Các tỷ lệ phần trăm định lượng này sẽ hiển thị trên một màn hình máy tính bảng tích hợp sẵn trong máy.

Nhiều nghiên cứu thực tế tại hiện trường đã chứng minh độ chính xác và tính hữu dụng của thiết bị này trong nhiều bối cảnh lâm sàng khác nhau. So với phương pháp HPLC, xét nghiệm “Gazelle Hb Variant” xác định chính xác các mẫu bệnh phẩm mang các kiểu hình Hb AA, Hb SA, Hb SS và Hb SC với độ chính xác đạt từ 96,6 đến 100%. Xét nghiệm Gazelle đang được sử dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới như một phương pháp sàng lọc và chẩn đoán ban đầu cho các rối loạn huyết sắc tố
11-13
.

Phương pháp Gazelle Hb Variant mang những hạn chế tương tự như điện di cellulose acetate; quan trọng nhất là không thể phân tách rõ ràng do hiện tượng chồng lấp giữa Hb C, Hb E và Hb O, cũng như giữa Hb D, Hb G và Hb S. Khi việc xác định Hb S và Hb C đóng vai trò cốt lõi (như ở phần lớn khu vực cận Sahara thuộc châu Phi), những hạn chế này không quá quan trọng; tuy nhiên, phương pháp này ít có giá trị trong chẩn đoán các bệnh thalassemia hoặc tại các vùng mà Hb E, Hb D và Hb O phổ biến hơn. (Xem thêm
‘Điện di trên nền gel’
ở trên).

HemoTypeSC

– “HemoTypeSC” (
hình 14
) là một xét nghiệm miễn dịch tại điểm chăm sóc dành cho bệnh hồng cầu liềm, sử dụng mẫu máu chích đầu ngón tay để tạo dung dịch ly giải hồng cầu. Dung dịch này được nhỏ vào một lọ chứa que thử có gắn sẵn các kháng thể đơn dòng kháng Hb A, Hb S và Hb C
14
. Xét nghiệm này áp dụng định dạng xét nghiệm miễn dịch sắc ký dòng chảy cạnh tranh (competitive lateral flow immunoassay – LFIA), trong đó các huyết sắc tố thuốc thử có gắn nhãn sẽ cạnh tranh với huyết sắc tố của bệnh nhân để gắn kết với các kháng thể đơn dòng cố định trên que thử. Do đó, sự hiện diện của một biến thể huyết sắc tố trong mẫu bệnh phẩm được chỉ điểm bằng sự vắng mặt của vạch màu đỏ tại vị trí vạch thử.

Khi đánh giá trên các mẫu máu toàn phần từ 100 cá thể, xét nghiệm này đã xác định chính xác tất cả các kiểu hình huyết sắc tố, bao gồm cả dạng đồng hợp tử và dị hợp tử của Hb A, Hb S và Hb C
14
. Trong một nghiên cứu tiếp theo bao gồm 587 người tham gia, độ nhạy và độ đặc hiệu đạt trên 99%
15
. Xét nghiệm rất dễ thực hiện vì không đòi hỏi quá trình đào tạo chuyên sâu hay các bước pha loãng phức tạp; tuy nhiên, việc diễn giải kết quả đôi khi có thể gây nhầm lẫn cho một số nhân viên y tế do sự vắng mặt của vạch màu lại chính là dấu hiệu cho biết có sự hiện diện của biến thể. Kết quả có sẵn chỉ trong vòng 10 phút. Các thử nghiệm tại thực địa và các nghiên cứu quy mô lớn tiếp tục cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao
16-18
. Xét nghiệm này được thiết kế để chẩn đoán các thể bệnh hồng cầu liềm (bệnh Hb SS và Hb SC); không dùng để chẩn đoán thalassemia hoặc các bất thường huyết sắc tố khác. Xét nghiệm HemoTypeSC hiện được cung cấp rộng rãi tại nhiều quốc gia ở tiểu vùng Sahara châu Phi.

Sickle SCAN

– “Sickle SCAN” (
hình 15
) là một xét nghiệm miễn dịch sắc ký dòng chảy (LFIA) tại điểm chăm sóc, thực hiện bằng cách hòa mẫu máu chích đầu ngón tay vào một ống đã được chuẩn bị sẵn dung dịch đệm để tạo dung dịch ly giải. Năm giọt dung dịch ly giải này được nhỏ vào một hộp chứa que thử, nơi có gắn sẵn các kháng thể đơn dòng kháng Hb S, Hb C và Hb A của người. Khi dung dịch ly giải khuếch tán qua que thử, các huyết sắc tố của bệnh nhân trước tiên sẽ gắn kết với kháng thể đơn dòng có gắn nhãn nhắm vào chuỗi alpha globin vốn có mặt ở tất cả các loại huyết sắc tố. Các phức hợp kháng nguyên – kháng thể được đánh dấu này sẽ gắn kết chọn lọc với các vạch thử chứa kháng thể đặc hiệu để phát hiện trực quan từng loại huyết sắc tố bình thường và biến thể. Kết quả có được sau 5 phút và thiết bị có thể sử dụng trên mẫu máu thấm khô hoặc mẫu máu bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong tối đa 1 tháng. Xét nghiệm Sickle SCAN hiện được lưu hành rộng rãi tại nhiều quốc gia vùng tiểu vùng Sahara châu Phi.

Trên các mẫu máu thu thập từ 137 cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử, xét nghiệm này đã phát hiện chính xác Hb A, Hb S và Hb C với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 99%
19
. Quá trình thẩm định tiếp theo trên các mẫu từ 71 cá thể đã biết rõ kiểu gen huyết sắc tố cho thấy độ nhạy đạt 100% và độ đặc hiệu gần như tuyệt đối
19
. Trong một phân tích riêng biệt trên 139 trẻ sơ sinh và người lớn, thiết bị đạt độ nhạy từ 98 đến 100% và độ đặc hiệu từ 93 đến 99% trong việc phát hiện Hb A và Hb S, đồng thời phân biệt được thể mang gene bệnh hồng cầu liềm với bệnh hồng cầu liềm và nhóm chứng
20
. Xét nghiệm này không phát hiện được nồng độ Hb A dưới 40%, đồng thời không thể phân biệt được những người mang thể bệnh kết hợp hồng cầu liềm – thalassemia thể beta dương ($^{+}$) với bệnh nhân mắc Hb SS hoặc hồng cầu liềm – thalassemia thể beta số ($^{0}$). Xét nghiệm cũng có nguy cơ nhiễu kết quả do các biến thể huyết sắc tố phản ứng chéo có chung epitope với Hb A.

Độ chính xác, tính hữu dụng và hiệu quả chi phí khi ứng dụng thực tế của xét nghiệm này đã được chứng minh tại các khu vực hạn chế về nguồn lực như Nigeria và Haiti, với độ nhạy dao động từ 90 đến 100% và độ đặc hiệu từ 97 đến 98%, lấy phương pháp HPLC làm tiêu chuẩn vàng
21,22
. Nghiên cứu tại Nigeria bao gồm 197 nhân viên y tế và 221 bệnh nhân, trong đó có hơn 97% bày tỏ sự sẵn lòng giới thiệu Sickle SCAN làm xét nghiệm sàng lọc bệnh hồng cầu liềm
21
. Nghiên cứu tại Haiti đã ghi nhận tính khả thi và độ chính xác của Sickle SCAN trong chương trình sàng lọc sơ sinh
22
. Khả năng thông báo kết quả ngay lập tức cho phụ huynh/người chăm sóc thay vì phải tìm kiếm và thông báo vào thời điểm sau đó đã giúp đẩy nhanh tiến độ khởi trị các can thiệp sớm như dự phòng bằng penicillin, tiêm vaccine phòng viêm phổi và tư vấn về bệnh lý. Các phân tích tiếp theo cũng ghi nhận độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao tại các cộng đồng dân cư khác
18,22-24
.

Những xét nghiệm POC này không thích hợp để chẩn đoán các bệnh thalassemia hoặc xác định các biến thể huyết sắc tố bất thường khác ngoài Hb C và Hb S.

Một hạn chế khác của cả hai xét nghiệm HemoTypeSC và Sickle SCAN là không thể phân biệt được thể mang gene bệnh hồng cầu liềm với thể hồng cầu liềm kết hợp thalassemia thể beta dương ($^{+})$; tương tự, thể mang gene Hb C cũng không thể phân biệt với thể Hb C kết hợp thalassemia thể beta dương ($^{+}$).

  • Kết quả “AS” phù hợp với cả trường hợp mang gene bệnh hồng cầu liềm lẫn thể hồng cầu liềm kết hợp thalassemia thể beta dương ($^{+}$).
  • Kết quả “AC” phù hợp với cả trường hợp mang gene Hb C lẫn thể Hb C kết hợp thalassemia thể beta dương ($^{+}$).

Tình trạng này xảy ra do phương pháp này không định lượng tỷ lệ tương đối giữa các loại huyết sắc tố khác nhau (A, S hoặc C). Cần phải thực hiện thêm các xét nghiệm bổ sung để đưa ra những phân định quan trọng này giữa thể mang gene (trait) và thể bệnh thực sự (disease states).

Các xét nghiệm đặc hiệu theo dõi bệnh khác

Có thể thực hiện các xét nghiệm khác để đánh giá tình trạng thiếu sắt hoặc các protoporphyrin hồng cầu, bao gồm protoporphyrin hồng cầu tự do không gắn kim loại (còn gọi là free erythrocyte protoporphyrin [FEP]) và kẽm protoporphyrin, nhằm tầm soát ngộ độc chì và thiếu sắt. (Xem
“Thiếu sắt ở trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 12 tuổi: Sàng lọc, dự phòng, biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán”
và
“Chẩn đoán thiếu sắt và thiếu máu thiếu sắt ở người lớn”.)

Đo quang phổ huyết sắc tố (Hemoximetry)

Phương pháp này đo lường ái lực gắn oxy của huyết sắc tố (Hb) thông qua việc xác định đường cong ly giải oxy-Hb hoặc đường cong cân bằng oxy.

Kết quả được biểu diễn dưới dạng áp lực riêng phần của oxy tại thời điểm Hb bão hòa 50% với oxy (p50).

  • Chỉ số p50 thấp cho thấy ái lực với oxy tăng.
  • Chỉ số p50 cao cho thấy ái lực với oxy giảm.

Xét nghiệm này hỗ trợ chẩn đoán các bệnh lý di truyền ảnh hưởng đến ái lực gắn oxy của Hb (bệnh lý huyết sắc tố và các bất thường nội tại khác của hồng cầu), vốn có thể biểu hiện bằng tình trạng thiếu máu, đa hồng cầu hoặc tím tái. Xét nghiệm này cũng giúp thu hẹp chẩn đoán phân biệt đối với các trường hợp thiếu máu mắc phải, đa hồng cầu hoặc tím tái, trong đó một số nguyên nhân có thể liên quan đến sự bất thường về ái lực oxy (ví dụ: ngộ độc carboxyhemoglobin hoặc methemoglobin). (Xem
“Methemoglobin máu”.)

Nhuộm thể Heinz và các xét nghiệm khác đánh giá hemoglobin không bền vững

Thể Heinz là các chất kết tủa hemoglobin (Hb) nằm bên trong hồng cầu, hình thành khi Hb bị biến tính, nhân heme tách ra khỏi khe chứa heme và gắn vào các vị trí khác trên chuỗi globin đã bị biến tính một phần (tạo thành hemichrome). Các thể kết tủa biến tính này thường bám vào bề mặt trong của màng hồng cầu.

Phương pháp chuẩn bị thể Heinz bao gồm việc ủ hồng cầu với một chất nhuộm sống (supravital stain) như xanh methylene (methylene blue) hoặc tím cristal (crystal violet).

Phương pháp này rất hữu ích khi nghi ngờ có các biến thể Hb không bền vững. Tuy nhiên, xét nghiệm này không đặc hiệu và có kết quả bất thường trong nhiều rối loạn khác ngoài các hemoglobin không bền vững 25. Bất kỳ nguyên nhân nào gây tan máu do stress oxy hóa, dù là bệnh lý enzym (thiếu hụt G6PD), tác nhân oxy hóa như dapsone, hay các Hb không bền vững, đều có thể sinh ra thể Heinz. Việc không tìm thấy thể Heinz không loại trừ khả năng có Hb không bền vững và kết quả đọc tiêu bản phụ thuộc rất nhiều vào kỹ năng của người làm xét nghiệm.

Do đó, xét nghiệm tìm thể Heinz chỉ nên được thực hiện tại các phòng thí nghiệm có đủ chuyên môn và cần được đánh giá trong bối cảnh các thông tin lâm sàng cũng như cận lâm sàng khác. (Xem “Các biến thể hemoglobin không bền vững”, phần ‘Xét nghiệm chuyên sâu’).

Các kỹ thuật biến tính bằng nhiệt hoặc isopropanol là xét nghiệm sàng lọc có độ đặc hiệu cao hơn đối với hemoglobin không bền vững so với phương pháp nhuộm thể Heinz 25. Ngày nay, xét nghiệm di truyền ngày càng được sử dụng thay thế (hoặc kết hợp cùng) các xét nghiệm biến tính Hb. Chi tiết và các nguồn lực để thực hiện xét nghiệm này được trình bày ở phần riêng. (Xem “Các biến thể hemoglobin không bền vững”, phần ‘Xét nghiệm chuyên sâu’).

Nhuộm thể Heinz/Hb H (Hb H staining)

Hb H là một thể tetramer không hòa tan của các chuỗi beta globin, có khả năng kết tủa bên trong hồng cầu; xuất hiện ở những người bệnh alpha thalassemia. Có thể quan sát Hb H bằng phương pháp nhuộm xanh methylene mới (new methylene blue – một loại phẩm chất hóa học có họ hàng với xanh methylene) hoặc xanh brilliant cresyl (brilliant cresyl blue).

Các thể vùi Hb H thường được mô tả giống như “quả bóng golf” do hình dạng đặc trưng của chúng (hình 1).

Kỹ thuật nhuộm Hb H không có tính đặc hiệu cao, vì các kết tủa protein hoặc axit nucleic khác (bao gồm cả Hb Barts, một thể tetramer của chuỗi gamma globin) cũng bắt màu khi nhuộm. Sự hiện diện của các thể vùi này là bằng chứng hỗ trợ cho chẩn đoán giả định bệnh Hb H, nhưng việc không tìm thấy chúng không loại trừ khả năng mang gene bệnh alpha thalassemia thể ẩn (alpha thalassemia trait). Kỹ thuật nhuộm Hb H cũng có thể hữu ích trong việc nhận diện hội chứng thiểu năng trí tuệ liên kết nhiễm sắc thể X do alpha thalassemia (ATR-X), gây ra bởi các biến thể gây bệnh trên gene ATRX.

Xét nghiệm sàng lọc hồng cầu hình liềm (Sickle cell prep)

Xét nghiệm sàng lọc hồng cầu hình liềm giúp phát hiện các hồng cầu chứa Hb S bằng cách xử lý mẫu máu với chất khử như sodium metabisulfite hoặc dithionite; các chất này làm giảm áp lực oxy trong mẫu và thúc đẩy quá trình chuyển dạng hồng cầu hình liềm, sau đó được quan sát bằng mắt thường. Xét nghiệm này không phân biệt được thể mang gene hồng cầu hình liềm (trait) với bệnh lý thực sự (disease) và không được khuyến cáo sử dụng thường quy trên lâm sàng.

Các trường hợp ngoại lệ bao gồm:

ĐÁNH GIÁ BAN ĐẦU

Chỉ định phân tích huyết sắc tố (hemoglobin)

Xét nghiệm hemoglobin có thể được chỉ định trong sàng lọc cộng đồng hoặc khi nghi ngờ một bệnh lý lâm sàng cụ thể:

Tổng quan về phương pháp tiếp cận

Chiến lược xét nghiệm phụ thuộc vào chỉ định (tầm soát quần thể hay đánh giá chẩn đoán lâm sàng), loại bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy) cần khảo sát, các đặc điểm lâm sàng đi kèm và nguồn lực hiện có.

Các thông tin quan trọng khác bao gồm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi (CBC), số lượng hồng cầu lưới, hình thái hồng cầu (RBC), cũng như nguồn gốc địa lý – dân tộc và kết quả xét nghiệm của các thành viên trong gia đình thế hệ thứ nhất (ví dụ: cha mẹ, anh chị em ruột). (Xem ‘Các gợi ý từ xét nghiệm CBC’ bên dưới.)

Một số lưu ý quan trọng cần áp dụng:

  • Kết quả xét nghiệm bệnh lý huyết sắc tố luôn phải được diễn giải trong bối cảnh bức tranh lâm sàng toàn diện. Tiền sử truyền máu, nguồn gốc địa lý và các thông số huyết học đóng vai trò cực kỳ hữu ích trong việc định hướng phương pháp tiếp cận. (Xem ‘Các gợi ý từ xét nghiệm CBC’ bên dưới.)
  • Tiền sử truyền máu gần đây có thể gây nhiễu cho các phương pháp dựa trên phân tích protein. Các giải pháp thay thế bao gồm chờ đợi cho đến khi qua thời điểm hơn 3 tháng kể từ lần truyền máu cuối cùng, hoặc sử dụng các phương pháp di truyền phân tử (dựa trên DNA) vốn không bị ảnh hưởng bởi việc truyền máu gần đây. (Xem ‘Các phương pháp di truyền phân tử (dựa trên DNA)’ ở trên.)
  • Kết quả ban đầu gợi ý bệnh lý Thalassemia hoặc một biến thể Hb khác thường được khẳng định lại bằng một phương pháp thay thế, đặc biệt khi phương pháp xét nghiệm ban đầu dựa trên nền tảng protein (ví dụ: sắc ký lỏng hiệu năng cao [HPLC], điện di hội tụ đẳng điện [IEF], điện di mao quản vùng [CZE]). Thực hành thông thường là sử dụng HPLC cho chương trình tầm soát trẻ sơ sinh, sau đó dùng IEF để khẳng định, hoặc ngược lại. (Xem ‘Các phương pháp xét nghiệm hiện có’ ở trên.)
  • Việc khẳng định bằng một kỹ thuật độc lập giúp làm sáng tỏ các kết quả chưa rõ ràng và định hướng quyết định xem có cần đánh giá bổ sung bằng phương pháp xét nghiệm phân tử để chẩn đoán xác định hay không, đặc biệt trong các thể Thalassemia. Thói quen sử dụng xét nghiệm khẳng định độc lập này cũng rất quan trọng khi biến thể phát hiện là dạng ít gặp hoặc chưa rõ ý nghĩa lâm sàng.
  • Tình trạng đồng mắc Alpha-thalassemia có thể làm thay đổi tỷ lệ các biến thể Hb, khiến việc diễn giải kết quả trở nên phức tạp hơn. Về nguyên tắc chung, sự hiện diện đồng thời của Alpha-thalassemia làm giảm nồng độ các chuỗi beta globin bất thường như Hb S, Hb C và làm tăng nồng độ các chuỗi alpha globin bất thường như Hb G-Philadelphia.
  • Tình trạng thiếu máu thiếu sắt đi kèm cũng có thể làm thay đổi kết quả xét nghiệm. Ở người trưởng thành đang được đánh giá về Thalassemia, việc thực hiện các xét nghiệm đánh giá chuyển hóa sắt thường rất hữu ích để hỗ trợ cho việc diễn giải kết quả xét nghiệm bệnh lý huyết sắc tố dựa trên protein. Ngoại lệ có thể áp dụng cho cá thể đang được tầm soát thể ẩn (trait) Thalassemia nhưng có kết quả xét nghiệm CBC tương đối bình thường.
  • Ở tất cả các giai đoạn xét nghiệm, các quy trình kiểm soát chất lượng cần được thiết lập nhằm giảm thiểu sai sót và nâng cao hiệu quả giao tiếp giữa phòng xét nghiệm, bác sĩ điều trị và người bệnh 5.

Những vấn đề này được thảo luận chi tiết hơn trong tài liệu năm 2015 từ Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) thuộc Bộ Y tế và Dịch vụ Nhân sinh Hoa Kỳ 5. Các phương pháp tiếp cận chung cho các tình huống lâm sàng phổ biến được trình bày trong các phần tiếp theo. (Xem ‘Các tình huống lâm sàng phổ biến’ bên dưới.)

Manh mối từ tổng phân tích tế bào máu ngoại vi

Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi (CBC) cung cấp những thông tin luôn cần được xem xét kỹ lưỡng. Các đặc điểm quan trọng bao gồm mức độ thiếu máu (hoặc đa hồng cầu), số lượng hồng cầu, các chỉ số hồng cầu, số lượng hồng cầu lưới và hình thái hồng cầu trên tiêu bản phết máu ngoại vi. (Xem “Đánh giá tiêu bản phết máu ngoại vi”, phần ‘Các bất thường về kích thước và hình dạng hồng cầu’.)

Các kết quả sau đây gợi ý những bệnh lý huyết sắc tố cụ thể:

  • Tế bào hình liềm (hình 2) – Gợi ý bệnh hồng cầu hình liềm (SCD), bao gồm bệnh thể đồng hợp tử Hb SS (Hb SS) và bệnh Hb S – beta thalassemia. Người mang gen bệnh hồng cầu hình liềm thường không xuất hiện tế bào hình liềm trên tiêu bản phết máu ngoại vi thông thường.
  • Tinh thể huyết sắc tố hình lục giác (hình 3) – Gợi ý bệnh thể đồng hợp tử Hb C (Hb CC).
  • Tế bào hình “thuyền con” (còn gọi là tế bào hình thuyền hoặc tế bào hình bánh mì pita) (hình 4) và tế bào hình bia súng – Thường xuất hiện trong bệnh Hb SC.
  • Tế bào hình bia súng (hình 5) – Có thể xuất hiện với số lượng ngày càng nhiều trong thể beta thalassemia ẩn (hình 6), thể NTDT (trước đây gọi là thalassemia trung gian) (hình 7) và thể TDT (trước đây gọi là thalassemia nặng); chúng cũng được quan sát thấy trong các bệnh lý huyết sắc tố khác như Hb C, Hb D và Hb E.
  • Tế bào hình giọt nước (hình 8) – Gợi ý bệnh beta thalassemia.
  • Tế bào khuyết một góc (hình 9) và/hoặc hồng cầu hình cầu (hình 10) – Có thể gặp ở một số biến thể huyết sắc tố không ổn định.

Một số bất thường này cũng xuất hiện trong các tình trạng không phải bệnh lý huyết sắc tố, chẳng hạn như tế bào hình bia súng trong bệnh lý gan, tế bào hình giọt nước trong xơ tủy xương, và hồng cầu hình cầu trong thiếu máu huyết tán tự miễn và bệnh hồng cầu hình cầu di truyền.

Nhìn chung, các bệnh lý huyết sắc tố không gây ra sự thay đổi về số lượng bạch cầu (WBC) hoặc tiểu cầu; những bất thường về số lượng hoặc sự phân bố của các tế bào này gợi ý một chẩn đoán thay thế hoặc chẩn đoán kèm theo. Một ngoại lệ đáng chú ý là bệnh hồng cầu hình liềm (SCD); khi chưa được điều trị, tình trạng tăng bạch cầu và tăng tiểu cầu thường xuyên xảy ra, trong khi việc sử dụng hydroxyurea lại gây ra tình trạng hồng cầu khổng lồ và thường làm giảm nhẹ số lượng bạch cầu cũng như tiểu cầu.

Các kịch bản lâm sàng thường gặp

Tầm soát quần thể (ví dụ: tầm soát thường quy ở trẻ sơ sinh)

Tại Hoa Kỳ và các quốc gia có nguồn lực y tế phát triển khác, trẻ sơ sinh được tầm soát thường quy các bệnh lý huyết sắc tố từ mẫu máu gót chân, thường sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hb S là một trong những phát hiện phổ biến nhất. Tại một số quần thể, bệnh thalassemia lại có tỷ lệ lưu hành cao hơn. (Xem “Tầm soát sơ sinh: Tổng quan”).

Phương pháp HPLC đặc biệt hữu ích trong việc chẩn đoán bệnh Hb H ở trẻ sơ sinh. Huyết sắc tố chủ đạo ở trẻ sơ sinh là Hb F (tetramer alpha:gamma [$\text{a}_2\gamma_2$]). Trong bệnh Hb H, quá trình tổng hợp chuỗi globin alpha giảm rõ rệt, và các chuỗi globin gamma dư thừa tạo thành một tetramer được gọi là Hb Barts. Nồng độ Hb Barts cao (ví dụ: >25%) trong vòng 12 đến 48 giờ sau sinh là dấu hiệu đặc trưng của bệnh Hb H. Ngưỡng phát hiện dựa trên dữ liệu thẩm định từ quần thể tham chiếu; con số này có thể khác nhau tùy theo vùng địa lý dựa trên các đột biến phổ biến tại quần thể đó 26. Nồng độ Hb Barts giảm nhanh chóng sau khi sinh. Các chương trình tầm soát trẻ sơ sinh cũng có thể phát hiện thể ẩn thalassemia alpha thông qua việc nhận diện nồng độ Hb Barts ở mức thấp.

Tất cả các kết quả tầm soát sơ sinh bất thường đều đòi hỏi phải làm xét nghiệm khẳng định trên mẫu máu thứ hai, bất kể phương pháp tầm soát ban đầu là gì và biểu hiện lâm sàng ra sao. Đối với các biểu đồ điện di phù hợp với bệnh hồng cầu hình liềm (SCD) và thalassemia bêta (lần lượt là mẫu chỉ có Hb S hoặc chỉ có Hb F), quy trình này có thể bao gồm một xét nghiệm dựa trên protein thứ hai. Một phương pháp bổ trợ được áp dụng nhằm đảm bảo không xảy ra sai sót về mặt phương pháp luận hoặc sai sót hành chính.

Xét nghiệm DNA là bắt buộc để đưa ra chẩn đoán xác định ở trẻ sơ sinh nghi ngờ mắc thalassemia alpha, nghi ngờ đồng thừa hưởng hai biến thể thalassemia bêta, hoặc nghi ngờ mắc Hb E kết hợp với một biến thể thalassemia bêta. Một số trẻ sơ sinh được xét nghiệm lại sau vài tháng, đặc biệt là trẻ sinh non có nồng độ Hb A rất thấp hoặc chỉ có Hb F (xem ‘Các huyết sắc tố bình thường’ ở trên), hoặc trẻ được truyền máu trước khi lấy mẫu tầm soát sơ sinh ban đầu. Ngoài ra, các phương pháp dựa trên DNA có thể được áp dụng ở bất kỳ độ tuổi nào. Xét nghiệm dựa trên DNA đã chứng minh được tính hữu ích như một phần trong quy trình tầm soát sơ sinh đối với bệnh SCD 6,7. (Xem ‘Các phương pháp di truyền phân tử (dựa trên DNA)’ ở trên.)

Tầm soát trước sinh

Xét nghiệm tầm soát trước sinh đối với các bệnh lý huyết sắc tố được bàn luận ở một phần riêng. (Xem “Bệnh lý huyết sắc tố: Tầm soát và tư vấn trong bối cảnh sinh sản và chẩn đoán trước sinh”).

Bệnh nhân nghi ngờ mắc rối loạn hồng cầu hình liềm

Có thể nghi ngờ một rối loạn hồng cầu hình liềm dựa vào tiền sử gia đình, xét nghiệm trước sinh, sàng lọc trẻ sơ sinh hoặc các đặc điểm lâm sàng (hiện tượng tắc mạch, thiếu máu huyết tán, sự xuất hiện của hồng cầu hình liềm trên tiêu bản máu ngoại vi) (hình ảnh 2).

Triệu chứng chưa xuất hiện ngay từ khi sinh ra vì các biến thể hồng cầu hình liềm chỉ ảnh hưởng đến chuỗi beta, trong khi quá trình chuyển đổi từ tổng hợp gamma globin sang beta globin diễn ra từ từ trong giai đoạn đầu đời của trẻ (hình 2). (Xem thêm “Tổng quan về các biểu hiện lâm sàng của bệnh hồng cầu hình liềm”).

Quy trình đánh giá tiêu chuẩn bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di vùng mao quản (CZE) hoặc điện di điểm đẳng điện (IEF), tiếp theo là các xét nghiệm bổ sung như điện di huyết sắc tố trong môi trường acid, tùy thuộc vào kết quả thu được (bảng 3). (Xem thêm “Chẩn đoán các rối loạn hồng cầu hình liềm” và “Tổng quan về các hội chứng hồng cầu hình liềm hỗn hợp”).

Bệnh nhân nghi ngờ mắc thalassemia

Thalassemia có thể được nghi ngờ dựa trên tiền sử gia đình, xét nghiệm tiền sản, các triệu chứng thiếu máu, hoặc kết quả tổng phân tích tế bào máu ngoại vi (CBC) (thiếu máu hồng cầu nhỏ, số lượng hồng cầu tăng, số lượng hồng cầu lưới giảm) và tiêu bản máu ngoại vi (hồng cầu nhỏ, hồng cầu hình bia súng, và các hình thái bất thường khác tùy thuộc vào mức độ nặng của bệnh) (hình 7 và hình 6 và hình 11).

Chẩn đoán phân biệt quan trọng nhất của thalassemia là thiếu máu thiếu sắt; cả hai tình trạng này đều gây thiếu máu hồng cầu nhỏ. Thiếu sắt có thể làm giảm nồng độ Hb A2, tương tự như alpha-thalassemia, làm cho việc chẩn đoán trở nên khó khăn hơn 27-29.

Việc xét nghiệm chẩn đoán thiếu sắt (và điều trị nếu cần thiết) thường được tiến hành trước khi xét nghiệm thalassemia, đặc biệt ở người trưởng thành có thiếu máu hồng cầu nhỏ. Trong thai kỳ, xét nghiệm tầm soát thiếu sắt được thực hiện đồng thời với xét nghiệm tầm soát mang gen bệnh thalassemia.

Các chỉ số tính toán như chỉ số Mentzer (tỷ số giữa thể tích trung bình hồng cầu [MCV] và số lượng hồng cầu) giúp dự đoán khả năng mang gen thalassemia và thiếu máu thiếu sắt nhưng không có giá trị chẩn đoán vững chắc 30-34.

Trên thực tế, việc xét nghiệm đồng thời thiếu sắt và mang gen thalassemia có thể đơn giản và tiết kiệm chi phí hơn. (Xem thêm “Thiếu máu thiếu sắt ở trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 12 tuổi: Tầm soát, dự phòng, biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán” và “Chẩn đoán thiếu máu thiếu sắt và thiếu máu do thiếu sắt ở người lớn”).

Đánh giá tiêu chuẩn đối với thalassemia bao gồm xét nghiệm protein ban đầu, thường bằng phương pháp điện di mao quản (CZE), sắc ký lỏng hiệu năng cao không phân cực (NPLC) hoặc tiêu huyết điện di (IEF), và các xét nghiệm tiếp theo được quyết định dựa trên thành phần hemoglobin (Hb) phát hiện được (bảng 4 và bảng 3):

  • Nghi ngờ alpha thalassemia

    Biểu hiện lâm sàng của alpha thalassemia có thể xuất hiện từ trong tử cung vì chuỗi alpha là một thành phần của Hb F ($\alpha_{2}\gamma_{2}$) và hai loại Hb phôi thai. Ví dụ điển hình nhất là alpha thalassemia đồng hợp tử, trong đó cả bốn gen tổng hợp chuỗi alpha globin đều bị tổn thương; tình trạng này thường gây ra phù thai rau thai. (Xem thêm “Phù thai không do miễn dịch” và “Alpha thalassemia thể nặng: Quản lý trước sinh và sau sinh”).

    Nếu xét nghiệm dựa trên protein ban đầu gợi ý alpha thalassemia (ví dụ: tăng Hb Barts khi sinh, thiếu máu hồng cầu nhỏ, sự hiện diện của Hb H) (bảng 4), bắt buộc phải sử dụng phương pháp dựa trên DNA để xác nhận. Hầu hết các biến thể alpha thalassemia là do mất đoạn, nhưng cũng có nhiều biến thể không mất đoạn. Do đó, việc kết hợp các phương pháp để phát hiện cả mất đoạn và đột biến điểm là rất quan trọng. Kỹ thuật PCR tách đoạn (gap-PCR) có thể phát hiện khoảng 80% các trường hợp mất đoạn alpha thalassemia; ngoài ra, phương pháp khuếch đại phụ thuộc đoạn mồi nhân lên (MLPA) có thể được sử dụng thay thế và phát hiện được nhiều trường hợp mất đoạn bổ sung. (Xem ‘Gap-PCR và MLPA’ ở trên).

    Giải trình tự DNA có thể được sử dụng để phát hiện các đột biến điểm chiếm khoảng 15% các trường hợp alpha thalassemia (ví dụ: Hb Constant Spring, đột biến poly-A). (Xem ‘Giải trình tự DNA truyền thống và PCR đặc hiệu alen’ ở trên).

    Đối với 5% trường hợp còn lại (hoặc dùng thay thế hoàn toàn cho gap-PCR), có thể sử dụng MLPA để phát hiện mất đoạn, tiếp theo là giải trình tự để xác định điểm đứt gãy và đặc điểm của đột biến mất đoạn, hoặc có thể sử dụng kỹ thuật lai so sánh hệ gen trên vi mảng (aCGH) để phát hiện sự hiện diện của mất đoạn và đặc trưng hóa đột biến mất đoạn cùng một lúc. Với các đoạn đọc đủ dài và độ sâu bao phủ cao, công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) cũng có thể được sử dụng. (Xem ‘Gap-PCR và MLPA’ ở trên và ‘Lai so sánh bộ gen trên vi mảng (Array CGH)’ ở trên).

  • Nghi ngờ beta thalassemia

    Các triệu chứng của beta thalassemia chưa xuất hiện khi sinh do chủ yếu Hb F ($\alpha_{2}\gamma_{2}$) được tổng hợp; quá trình sản xuất beta globin tăng dần trong giai đoạn đầu đời (hình 2). (Xem thêm “Chẩn đoán thalassemia (người lớn và trẻ em)”).

    Nếu xét nghiệm dựa trên protein ban đầu gợi ý beta thalassemia (ví dụ: tăng Hb A2) (bảng 3), có thể sử dụng phương pháp dựa trên protein thứ hai hoặc phương pháp dựa trên DNA (xem ‘Các phương pháp hóa học protein’ ở trên). Hầu hết các biến thể beta thalassemia là đột biến điểm. Do đó, khi sử dụng xét nghiệm DNA, beta thalassemia có thể được phát hiện bằng xét nghiệm dựa trên PCR định hướng hoặc giải trình tự truyền thống (xem ‘Giải trình tự DNA truyền thống và PCR đặc hiệu alen’ ở trên). Nếu không tìm thấy đột biến điểm, có thể tiến hành sàng lọc bằng MLPA, với các điểm đứt gãy mất đoạn được xác định bằng PCR đặc hiệu alen hoặc giải trình tự truyền thống. Việc ứng dụng aCGH để chẩn đoán beta thalassemia hiện chỉ giới hạn ở các phòng xét nghiệm tuyến trung ương/tham chiếu có nhân sự được đào tạo phù hợp. Với các đoạn đọc đủ dài và độ sâu bao phủ cao, NGS cũng có thể được sử dụng.

Người bệnh mang biến thể chưa rõ ý nghĩa

Các biến thể chưa rõ ý nghĩa thường được phát hiện trong quá trình đánh giá các bệnh lý huyết sắc tố phổ biến (bệnh hồng cầu liềm hoặc bệnh Thalassemia) 35,36. Tình trạng này cũng có thể được nghi ngờ ở những người bệnh đang được thăm khám để tầm soát huyết sắc tố không ổn định, methemoglobin máu di truyền, hoặc các rối loạn có ái lực oxy cao hoặc thấp — tất cả đều là những bệnh lý tương đối ít gặp. (Xem thêm “Các biến thể huyết sắc tố không ổn định”, “Methemoglobin máu” và “Các biến thể huyết sắc tố làm thay đổi ái lực huyết sắc tố – oxy”).

CHỈ ĐỊNH XÉT NGHIỆM TẠI PHÒNG XÉT NGHIỆM CHUYÊN SÂU

Quyết định gửi mẫu máu của người bệnh đến một phòng xét nghiệm tham chiếu bên ngoài thường được đưa ra trong các trường hợp sau:

  • Phát hiện biến thể hemoglobin, nhưng không thể xác định rõ bất thường cụ thể bằng các xét nghiệm thường quy.
  • Nghi ngờ có hemoglobin bất thường dựa trên lâm sàng hoặc xét nghiệm nhưng không thể phát hiện bằng các phương pháp thường quy đã nêu trên. Ví dụ bao gồm:
    • Thiếu máu tán huyết dương tính với thể Heinz và nghi ngờ biến thể hemoglobin không bền.
    • Đa hồng cầu không rõ nguyên nhân và nghi ngờ biến thể hemoglobin có ái lực oxy cao.
    • Thiếu máu hồng cầu bình thường, huyết sắc tố bình thường không rõ nguyên nhân và nghi ngờ biến thể hemoglobin có ái lực oxy thấp.
    • Tím tái, methemoglobin máu và nghi ngờ bệnh lý hemoglobin M.
    • Hồng cầu nhỏ hoặc thiếu máu hồng cầu nhỏ nhưng kết quả xét nghiệm thiếu sắt âm tính.

Việc lựa chọn phòng xét nghiệm tham chiếu có thể phụ thuộc vào các thỏa thuận hợp đồng với một trong các phòng xét nghiệm tham chiếu quốc gia hoặc sự ưu tiên tại địa phương đối với một số phòng xét nghiệm chuyên sâu nhất định. Về lý tưởng, nên chọn phòng xét nghiệm có sự tham gia biện giải và giám sát bởi chuyên gia về bệnh lý huyết sắc tố (hemoglobinopathy). Các phòng xét nghiệm học thuật tại Hoa Kỳ chuyên phân tích các hemoglobin bất thường bao gồm:

Erythrocyte Diagnostic Laboratory tại Trung tâm Y tế Bệnh viện Nhi đồng Cincinnati, Cincinnati, OH

Hemoglobin Diagnostic Reference Laboratory tại Đại học Boston, Boston, MA

Hemoglobinopathy laboratory tại Bệnh viện Nhi đồng UCSF Benioff, Oakland, CA

Mayo Medical Laboratories tại Mayo Clinic, Rochester, MN

Titus HJ Huisman Hemoglobinopathy Laboratory

gợi ý cho bạn

Chuyên khoa